pcr實驗室布局

　　要完成一組pcr實驗，通常需要經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴增和產(chǎn)物分析4個實驗過程。這4個實驗過程的實驗用房應相鄰布置，組成一個獨立的pcr實驗區(qū)。標準的pcr實驗區(qū)包括:試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)、各區(qū)配套的緩沖區(qū)及公共走廊。

       試劑準備區(qū)

　　該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。

　　試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。

　　試劑準備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內(nèi)。

　　房間的面積宜控制在15m2~20m2。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對正壓狀態(tài)，以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染。

　　標本制備區(qū)

　　該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。

　　標本制備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內(nèi)。在標本制備區(qū)，還需要配備生物安全柜，用于進行提取核酸的操作。

　　為避免提取的核酸在柜內(nèi)反復循環(huán)，造成標本之間的交叉污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，該區(qū)域配備的生物安全柜必須是B2型的。生物安全柜工作區(qū)垂直氣流全部來自實驗室，排風經(jīng)過高效過濾器過濾后直接排至室外，不允許回到安全柜和實驗室中。

　　根據(jù)經(jīng)驗，如果實驗室內(nèi)配備生物安全柜，每配備一臺，實驗室的面積增加10m2;標本制備區(qū)的面積宜在25m2~30m2之間。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。

　　擴增室

　　該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進 行。

　　在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。

　　擴增室主要配備PCR實驗室的核心儀器PCR儀，本文實例中使用了ABI7500和ABI9700兩種PCR儀。

　　在實驗室建造過程中，需要給PCR儀配備專門的UPS電源，以保證其正常工作。該區(qū)面積控制在15㎡~20㎡。

　　本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內(nèi)進行。建議采用  5~10Pa壓差，在控制上比較容易實現(xiàn)。

　　產(chǎn)物分析區(qū)

　　該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。

　　在室內(nèi)配備通風櫥，保證房間內(nèi)的相對負壓，空氣從室外流向室內(nèi)。該區(qū)面積控制在15㎡~20㎡。

　　本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實現(xiàn)。

　　正負壓區(qū)域緩沖室的設置

　　根據(jù)壓力梯度的要求，試劑配制室和樣品處理室為相對正壓，擴增室和產(chǎn)物分析室為相對負壓，要求正壓的區(qū)域和要求負壓的區(qū)域的緩沖室內(nèi)的壓力設計大不相同。